|
|
Mutační analýza biosyntézy manumycinových antibiotik
Kolek, Jan ; Petříček, Miroslav (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Mutační analýza biosyntézy manumycinových antibiotik Manumycinová antibiotika jsou sekundární metabolity, které patří do velké skupiny polyketidových látek. Jsou produkována výhradně bakteriemi rodu Streptomyces. Manumycinová antibiotika jsou charakterizována dvěma lineárními polyketidovými řetězci, které jsou připojeny k centrální mC7N podjednotce. Spodní řetězec je často zakončen C5N podjednotkou. Manumyciny vykazují mnoho biologických aktivit. Byla u nich prokázána antimikrobiální aktivita výhradně vůči gram-pozitivním bakteriím. Dalšími pozorovanými aktivitami je například antimykotická, insekticidní nebo protizánětlivá aktivita. Manumycinové metabolity jsou také potencionálními kancerostatiky. Pro přípravu těchto látek fermentační cestou je důležitá znalost jejich biosyntetických drah. Mutační analýza je založena na technikách genového inženýrství. Je vhodná ke zkoumání biosyntetických drah sekundárních metabolitů a také genů zapojených do jejich genetického podkladu. Jejím výsledkem je komplexní přehled o biosyntetické dráze daného metabolitu. Tuto znalost lze použít např. v metodách kombinatorní biosyntézy nebo mutasyntézy k produkci nových metabolitů. Hybridní látky by se mohly v budoucnosti stát např. novými účinnými antibiotiky nebo kancerostatiky pro použití v lékařství. Klíčová slova: manumycin,...
|
|
|
Povrchový růst a diferenciace streptomycet na inertních mikrokuličkách - morfologická a proteomová analýza
Tesařová, Eva ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Streptomycety jsou vláknité, Gram-pozitivní bakterie, které jsou producenty více než 70 % všech prakticky využívaných antibiotik. Jsou zajímavé svým poměrně komplikovaným životním cyklem (morfologická diferenciace), který ústí ve vznik dormantních spor odolných vůči nepříznivým podmínkám a umožňujícím dlouhodobé přežití organizmu. Jejich přirozeným prostředím je hlavně půda. V laboratorních podmínkách jsou pěstované na pevném agaru a v tekutém médiu. V naší laboratoři byl vyvinut nový dvoufázový kultivační systém, který umožňuje reprodukovatelnou a kvantitativní přípravu vzorků pro proteomickou, transkriptomickou a metabolomickou analýzu diferenciace streptomycet. Tento systém je tvořen inertními mikrokuličkami a kapalným médiem. V naší studii byly použity dva druhy mikrokuliček - skleněné a zirkoniové. Sledovali jsme povrchový růst a diferenciaci streptomycet na těchto dvou druzích mikrokuliček optickou a elektronovou mikroskopií (SEM). Zjistili jsme podstatně větší nárůst streptomycet a vyšší produkci antibiotik na skleněných mikrokuličkách. Dalším rozdílem byl i tvar a velikost kolonií. V další části jsme se snažili pomocí srovnávací proteomiky identifikovat proteiny, které se podílejí na rozpoznání a přichycení vegetativních hyf na rozdílné povrchy. Ve třech experimentech a prostřednictvím...
|
|
|
Analýza genového shluku kódujícího biosyntézu manumycinového antibiotika U-62162 a způsoby jeho modifikace
Urbanová, Daniela ; Petříček, Miroslav (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Bakterie rodu Streptomyces jsou největšími producenty antibiotik mezi mikroorganizmy. Malou skupinou těchto látek jsou manumycinová antibiotika. Jejich antibiotické účinky nejsou příliš významné, zato vykazují biologické vlastnosti, které mají potenciál pro využití například v léčbě zánětů, nádorů či Alzheimerovy choroby. Struktura manumycinových látek je tvořena centrální jednotkou, na kterou se váže horní a spodní polyketidový řetězec, na konci spodního řetězce je pak většinou připojená tzv. C5N jednotka. Látka U-62162 produkovaná Streptomyces verdensis se od ostatních členů manumycinové skupiny výrazně odlišuje strukturou spodního řetězce, který je zcela nasycený a postrádá C5N jednotku. Genový shluk kódující biosyntézu U-62162 byl osekvenován a u identifikovaných ORF byly navrženy proteinové produkty. Heterologní exprese tohoto shluku ukázala, že některé geny pro syntézu horního řetězce jsou kódovány na jiném místě chromozomu. Inserční inaktivací genu vrdER bylo potvrzeno, že za nasycenost spodního řetězce je zodpovědná enoylreduktáza. Biosyntézy se naopak zřejmě neúčastní DSBA oxidoreduktáza, jejíž gen je na kraji tohoto shluku. Vložení genů pro syntézu C5N jednotky nemělo za následek vznik derivátů s touto jednotkou připojenou na spodní řetězec, ať nasycený nebo nenasycený. Příčina...
|
|
|
Analysis and mapping of binding sites of gene expression regulators in the genus of Streptomyces.
Šmídová, Klára ; Bobek, Jan (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Kopecký, Jan (oponent)
Streptomycety jsou lékařsky důležité bakterie žijící v půdě, které podléhají morfologickým změnám od spór po vzdušné hyfy a jsou důležitými producenti bioaktivních látek včetně antibiotik. Jejich genová exprese je přísně regulována v časných úrovních transkripce a translace. Během řízení transkripce hrají sigma faktory ústřední roli; modelový organismus Streptomyces coelicolor má ohromujících 65 sigma faktorů. Exprese sigma faktorů samotných je řízena na post-transkripční úrovni působením malých RNA molekul, které modifikují hladinu jejich messengerových RNA. Avšak pouze několik sigma faktorů ve streptomycetách má známé regulony a také jejich regulace prostřednictvím malých RNA molekul nebyla dosud studována. V závislosti na předtím naměřených datech o genové expresi jsme vybrali několik vysoce exprimovaných sigma faktorů. Pomocí mutantních kmenů nesoucích sigma faktory značené HA tagem byly analyzovány regulony dvou důležitých sigma faktorů, SigQ a HrdB, pomocí techniky ChIP-seq. Další sigma faktory byly dále studovány pomocí metody 5 ' a 3' RACE a Northern blottingu, aby se zjistilo, zda mají asRNA. Naše data potvrzují nezbytnost sigma faktoru HrdB během vegetativní fáze růstu. Ukázalo se, že druhý sigma faktor, SigQ, je důležitým regulátorem metabolismu dusíku a regulátorem reakce na osmotický...
|
|
|
Biosyntéza propylprolinové stavební jednotky linkomycinu
Jirásková, Petra ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Čejková, Alena (oponent) ; Fišer, Radovan (oponent)
Klinicky využívané antibiotikum linkomycin se skládá z aminocukerné a aminokyselinové části, kterou je 4-propyl-L-prolin (PPL). Tato jednotka je velmi důležitá z hlediska bioaktivity tohoto antibiotika, což je patrné z nižší aktivity příbuzného antibiotika celesticetinu, který inkorporuje do struktury proteinogenní L-prolin. Genové shluky pro biosyntézu obou linkosamidů jsou publikovány a odrážejí společný základ - biosyntézu aminocukerného prekurzoru a kondenzační reakce. Ovšem v genovém shluku pro biosyntézu linkomycinu se nacházejí navíc geny kódující biosyntézu specifické aminokyseliny PPL. Tento alkylprolinový derivát (APD) má společný biosyntetický původ s dalšími APD, které jsou součástí struktur protinádorových pyrrolobenzodiazepinů a signální molekuly hormaomycinu, což se odráží i v přítomnosti homologních genů v jejich genových shlucích. Výsledky výzkumu biosyntézy PPL se tedy uplatní pro větší skupinu přírodních látek. První celkový koncept biosyntézy APD byl publikován již před čtyřiceti lety. Milníkem byl pak rok 1995, kdy byl publikován genový shluk pro biosyntézu linkomycinu a k jednotlivým reakcím biosyntézy byly navrženy konkrétní genové produkty. Funkční prokázání proteinů bylo provedeno zatím u prvních dvou kroků biosyntézy APD (proteiny LmbB2 a LmbB1), která vychází z...
|
|
|
Analýza izolátů streptomycet obsahujících gen pro cyklizující aminolevulinátsyntázu
Rašmanová, Petra ; Petříčková, Kateřina (vedoucí práce) ; Felsberg, Jurgen (oponent)
Bakterie rodu Streptomyces jsou známí producenti mnoha biologicky aktivních metabolitů. Jejich sekundární metabolismus je zdrojem mnoha významných skupin aktivních látek, při jejichž výzkumu se poslední dobou uplatňuje celá řada nových metod založených např. na bioinformatické analýze genomových dat, moderních LC-MS technikách a metodách metabolického modelování. Tato práce vychází z genetického screeningu na přítomnost specifického genu (als) pro cyklizující aminolevulinát syntázu, který dle dřívějších studií můžeme považovat za genetickou značku producentů sekundárních metabolitů s tzv. C5N jednotkou (2-amino-3- hydroxycyklopent-2-enonem). Mezi takové látky se řadí několik skupin metabolitů s variabilní strukturou i biologickou aktivitou, mezi nimi i manumyciny. Jedná se o malé polyketidy se slabou antibiotickou aktivitou zejména proti gram-pozitivním bakteriím. Důležitější jsou však jejich kancerostatické a protizánětlivé účinky. Kmeny Streptomyces monomycini BCCO10 1552 a Streptomyces capoamus BCCO10 1636 jsou pozitivními izoláty pocházejícími z genetického screeningu zaměřeného na přítomnost genu als, které se ve fylogenetickém stromu sestrojeném na základě podobnosti sekvencí genu als nacházejí v blízkosti producentů manumycinových látek. Cílem této práce bylo zjistit, zdali tyto nové...
|
|
|
Charakterizace antibiotických aktivit nepatogenních streptomycet izolovaných z lidských tkání.
ŽLÁBKOVÁ, Zuzana
Bakalářská práce se zabývá charakterizací deseti zástupců streptomycet izolovaných z lidských klinických vzorků. Streptomycety jsou půdní bakterie známé svou produkcí sekundárních metabolitů s charakteristickými antibiotickými, antihelmitickými, protinádorovými a antivirovými účinky. Cílem práce je mikrobiologicky charakterizovat antibakteriální a antifungální aktivity u těchto cca deseti taxonomicky zařazených izolátů na zástupcích typických lidských patogenů ze skupiny Gram-pozitivních i Gram-negativních bakterií, kvasinek a plísní.
|
|
|
Identifikace a aktivace kryptického genového shluku pro biosyntézu látek manumycinového typu u Saccharothrix espanaensis DSM44229
Zelenka, Tomáš ; Petříčková, Kateřina (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
1 Abstrakt: Sekundární metabolismus grampozitivních půdních bakterií rodu Streptomyces je neocenitelným významným zdrojem přírodních produktů, mezi které patří i skupina polyketidových látek, manumycinů. Tyto látky vykazují kromě slabého antimikrobiálního účinku významné protizánětlivé a protinádorové aktivity. Rod Streptomyces skýtá značné množství dosud neobjevených, potenciálně klinicky využitelných antibiotik, což dělá z těchto organismů nadějné řešení současného problému rozvoje antibiotikových rezistencí u mikroorganismů. Výzkum se ubírá dvěma hlavními směry, jednak je zde snaha o "umělé" vytváření různých modifikací ve struktuře molekul a o porozumění jejich funkcím, jednak jde o objevování úplně nových producentů metodami "genome miningu", optimalizace postupů pro probouzení skrytých kryptických genových shluků a zvýšení produkce požadovaných metabolitů. Jeden z mnoha takových tichých shluků obsahuje i Saccharothrix espanaensis DSM44229. Tato genetická informace byla s cílem charakterizace jejího produktu přenesena do heterologního hostitele, kde následně došlo k aktivaci a produkci nových látek manumycinového typu.
|
|
|
Analýza genového shluku kódujícího biosyntézu manumycinového antibiotika U-62162 a způsoby jeho modifikace
Urbanová, Daniela ; Petříček, Miroslav (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Bakterie rodu Streptomyces jsou největšími producenty antibiotik mezi mikroorganizmy. Malou skupinou těchto látek jsou manumycinová antibiotika. Jejich antibiotické účinky nejsou příliš významné, zato vykazují biologické vlastnosti, které mají potenciál pro využití například v léčbě zánětů, nádorů či Alzheimerovy choroby. Struktura manumycinových látek je tvořena centrální jednotkou, na kterou se váže horní a spodní polyketidový řetězec, na konci spodního řetězce je pak většinou připojená tzv. C5N jednotka. Látka U-62162 produkovaná Streptomyces verdensis se od ostatních členů manumycinové skupiny výrazně odlišuje strukturou spodního řetězce, který je zcela nasycený a postrádá C5N jednotku. Genový shluk kódující biosyntézu U-62162 byl osekvenován a u identifikovaných ORF byly navrženy proteinové produkty. Heterologní exprese tohoto shluku ukázala, že některé geny pro syntézu horního řetězce jsou kódovány na jiném místě chromozomu. Inserční inaktivací genu vrdER bylo potvrzeno, že za nasycenost spodního řetězce je zodpovědná enoylreduktáza. Biosyntézy se naopak zřejmě neúčastní DSBA oxidoreduktáza, jejíž gen je na kraji tohoto shluku. Vložení genů pro syntézu C5N jednotky nemělo za následek vznik derivátů s touto jednotkou připojenou na spodní řetězec, ať nasycený nebo nenasycený. Příčina...
|
|
|
Biosyntéza spodních polyketidových řetězců manumycinových antibiotik - faktory ovlivňující jejich délku
Kolek, Jan ; Petříček, Miroslav (vedoucí práce) ; Seydlová, Gabriela (oponent)
Manumycinová antibiotika jsou významnou skupinou sekundárních metabolitů produkovaných bakteriemi rodu Streptomyces. Patří do velké skupiny polyketidových látek a vykazují významné antimikrobiální, protizánětlivé, protinádorové a mnohé další biologické aktivity. Jsou charakterizována dvěma krátkými lineárními polyketidovými řetězci, které jsou připojené k centrální podjednotce. Polyketidové řetězce jsou syntetizovány enzymy iterativní polyketid-syntázy typu II. U manumycinových antibiotik prozatím nebyl popsán způsob regulace délky syntetizovaných krátkých polyketidových řetězců. Dokonalé pochopení mechanismu této regulace by bylo využitelné k následné syntéze manumycinových antibiotik s přesně definovanou délkou řetězců, které by mohly vykazovat lepší biologické účinky využitelné v praxi. K identifikaci faktoru zodpovědného za regulaci délky spodního řetězce u manumycinových antibiotik byl vytvořen mutantní kmen producenta asukamycinu Streptomyces nodosus ssp. asukaensis s deletovanými geny pro β-ketoacylsyntázu typu I/II a pro protein AsuC14, který by mohl být potenciálním faktorem určujícím délku spodního řetězce. Následně byly v tomto mutantním kmenu exprimovány geny pro β-ketoacylsyntázu typu I/II a potenciální faktor ovlivňující délku řetězce C14 z jiných producentů manumycinových...
|
host ::
RSS.